药包材细胞毒性试验方法公示

药包材细胞毒性试验方法系将供试品或供试品溶液接触细胞，通过对细胞形态、增殖和抑制影响的观察，评价供试品对体外细胞的毒性作用。

试验用细胞 推荐使用小鼠成纤维细胞 L-929。试验时采用传代 48～72 小时生长旺盛的细胞。

试验前的准备 与样品及细胞接触的所有器具均需无菌。必要时可采用湿热灭菌，如 115℃保持 30 分钟；干热灭菌，如 250℃保持 30 分钟或用 180℃保持2 小时。供试品溶液的制备 取供试品，按照“药包材生物学评价与试验选择指导原则（9651）”中生物学试验的要求制备供试品溶液。

第一法 相对增殖度法

阴性对照液制备 为不加供试品的细胞培养液。

阳性对照液制备 取阳性参比物，按照供试品溶液的制备项下的规定进行，也可使用 6.3%苯酚的细胞培养液。

试验方法 取 33 个培养瓶，分别加入 4×10 16 4个/mL 浓度的细胞悬液 1mL，细胞培养液 4mL，在 37℃±1℃，5%±1%CO2的条件下培养 24 小时。培养 24 小时后弃去原培养液。

阴性对照组： 取 13 个培养瓶分别加入 5mL 阴性对照液；

阳性对照组： 取 10 个培养瓶分别加入 5mL 阳性对照液。

供试品组： 取 10 个培养瓶分别加入 5mL 含 50%供试品溶液的细胞培养液，在 37℃±1℃，5%±1% CO2条件下继续培养 7 天。

细胞形态学观察和计数：在更换细胞培养液的当天，取 3 瓶阴性对照组，并在更换后第 7 天，每组各取 3 瓶进行细胞形态观察和细胞计数。

毒性评定 细胞形态分析标准按表 1 规定进行。

     细胞相对增殖度分级标准按表 2 规定进行。

结果评价 供试品组相对增殖度（以第 7 天的细胞浓度计算）为 0 级或 1级判为合格。试验组相对增殖度为 2 级，应结合形态综合评价，轻微毒或无毒的判为合格。试验组相对增殖度为 3～5 级判为不合格。

第二法 琼脂扩散法

本法适用于弹性体细胞毒性的测定。当聚合物供试品中可滤取的化学物质扩散时，琼脂层可起到隔垫的作用保护细胞免受机械损伤。供试品溶液将通过一张滤纸（表面积不小于 100mm 37 2）进行试验。

阴性对照制备 取阴性参比物，例如高密度聚乙烯，按照供试品溶液的制备项下的规定进行。

阳性对照制备 取阳性参比物，例如二乙基二硫代氨基甲酸锌的聚氨酯（ZDEC），按照供试品溶液的制备项下的规定进行。可采用 10%二甲基亚砜（DMSO）溶液，附着到生物惰性吸收性（例如超细硼硅玻璃纤维滤纸）的基质上。

试验方法 取细胞悬浮液（1×10 44 5个/mL）7mL，均匀分散至直径 60mm 的培养皿中。置于 37℃±1℃，含 5%±1% CO2气体的细胞培养箱中培养 24 小时至近汇合单层细胞，弃去培养皿中培养基，将溶化琼脂冷却至 48℃左右与含 20%血清的2倍新鲜哺乳动物细胞培养基混合，使琼脂最终质量浓度不大于 2%，在每只培养皿内加入新制备的含琼脂培养基（要足够薄以利于可沥滤物的扩散）。

含琼脂培养基凝固后，可用适当的染色方法染色。将供试品、阴性对照、阳性对照小心地放在培养皿的固化琼脂层表面。

每个供试品、阴性对照、阳性对照试样间尽量保持合适的距离并远离培养皿壁，每一培养皿中放置不超过 3 个试样，每个试样至少设置 2 个平行。置37℃±1℃，5%±1%CO2的细胞培养箱中至少培养 24 小时±2 小时。用显微镜观察每个供试品、阴性对照、阳性对照试样反应区域。用活体染料，如中性红有助于检测细胞毒性。

结果评价 按表 3 进行细胞毒性评价和分级。如阴性对照为 0 级（无毒）、

      阳性对照不小于 3 级（中度毒），则细胞培养试验系统有效。

供试品和/或供试品溶液细胞毒性分级不大于 2 级（轻度毒）时，则判为合格。

第三法 直接接触法

供试品制备 采用供试品的平整部分，表面积不小于 100mm 62 2。

阴性对照制备 取阴性参比物，例如高密度聚乙烯，按与供试品相同方式制备。

阳性对照制备 取阳性参比物，与供试品相同方式制备。

试验方法 取生长旺盛的细胞悬浮液（1×10 66 5个/mL）2mL，置直径 35mm 的

平皿中培养单层细胞。置于细胞培养箱中培养 24 小时至近汇合单层细胞，吸去培养基，替换为 0.8mL 的新鲜培养基。

在每个培养皿中单独放置 1 个供试品、阳性对照或阴性对照，每个试样至少设置 2 个平行。将所有的培养物置 37℃±1℃含 5%±1%CO2的细胞培养箱中至少培养 24 小时，培养箱宜保持适当的湿度。显微镜下观察每个供试品、阴性对照、阳性对照周围，必要时应进行染色。

结果评价 按照琼脂扩散法结果评价项下的规定进行。若样品不超过 2 级（轻度毒），则样品判为合格。若试验系统无效需重复试验过程。

 第四法 浸提法

阴性对照制备 取阴性参比物，例如高密度聚乙烯，按照供试品溶液的制备项下的规定进行。

阳性对照制备 取阳性参比物，按照供试品溶液的制备项下的规定进行

试验方法 取生长旺盛的细胞悬浮液（1×10 79 5 个/mL）2mL，置直径 35mm的平皿中培养单层细胞。培养不少于 24 小时至细胞至少达到 80%近汇合后，吸去培养基，替换为供试品溶液、阴性对照液或阳性对照液。含血清培养基提取液和不含血清培养基提取液无需稀释，平行试验 2 份。0.9%氯化钠注射液为介质的提取液用含血清的细胞培养基稀释至提取液浓度为 25%，平行试验 2 份。所有的培养物在 37℃±1℃，含 5%±1%CO2的培养箱中培养 48 小时。48 小时后，在显微镜下观察培养物，如有必要，进行染色。

结果评价 按表 4 进行毒性评价和分级。若试验系统不成立，重复试验。供试品不超过 2 级（轻度毒），则判为合格。如需进行剂量-反应程度评价，可通过定量稀释样品提取液，重复试验。

来源：药典委会员会

附4-药包材细胞毒性试验方法 .pdf